متیلن بلو قبلا در درمان موارد متهموگلوبینمی (مانند مسمومیت با سیانید) استفاده می‌شد، اخیرا در درمان آلزایمر نیز مطرح شده‌است. همچنین فرم خوراکی آن در دندانپزشکی برای تشخیص مناطق دارای پلاک میکروبی دندان و نیز در تشخیص فیستول در جراحی استفاده می‌شودمتیلن بلو یک ماده رنگزای فونکسیونل که به عنوان یک رد-اُکس-ایندیکاتورعمل کرده و درحالت‌های اکسید یا احیاء شده دارای رنگهای مختلف (آبی /بی رنگ) می‌باشد.یکی از آزمایش‌های تعیین کیفیت شیر که با آن تعداد باکتری‌های موجود در شیر خام تخمین زده می‌شود، آزمایش احیای متیلن بلو است .

محیط کشت ائوزین متیلن بلو در کشت میکروب‌ها به کار می‌رود.متیلن بلو برای رنگ آمیزی بافتها نیز استفاده می‌شود.
.