کوتریموکسازول در واقع از ترکیب دو آنتی بیوتیک تری متو پریم و سولفامتوکسازول (از گروه سولفونامیدها) به نسبت ۴۰۰ به ۸۰ ساخته شده‌است. هردو اين تركيبات از راههای مختلف در متابوليسم اسيد فوليك در باكتريها ايجاد اختلال می كنند. سولفاناميدها متوقف كننده رشد باكتری هستند. آنها با اسيدپاراآمينوبنزوئيك (PABA )شباهت ساختمانی داشته و بطور رقابتی يك آنزيم باكتريايی بنام دی هيدروپتروات سنتتاز را كه مسئول داخل كردن PABA در ساختمان اسيد دی هيدروفوليك است ، مهار می كنند . اين عمل ساخت اسيد دی هيدروفوليك را كه از نظر متابولیک كوفاكتور در ساخت پورين ها ، تيميدين و DNA مي باشد را كاهش می دهد .

تریمتوپریم با تداخل در عملکرد آنزیم دی هیدروفولات ردوکتاز باکتریها ساخت اسيد تترا هيدروفوليك را مهار میکند. تتراهیدروفولیک اسید كوفاكتور ضروری در ساخت تیمیدین و DNA می باشد. باكتریهایی كه اسيد فوليك را خودشان توليد می كنند به این دارو حساس هستند لذا این دارو تکثیر آنها را متوقف میکند.

لذا با استفاده از ترکیب کوتریموکسازول متابولیسم اسیدفولیک در باکتریها با دو مکانیسم متفاوت مختل میشود.